流式細胞分析時，樣本細胞中一般都含有一定量的死細胞，通過一定的方法可以減少樣本中死細胞的比例，但是完全去除樣本中的死細胞幾乎是不可能的。但流式分析的目標為活細胞，因此流式分析時將死細胞當作活細胞來分析，會嚴重影響流式分析的結果，通常可以選擇熒光染料來標記區分死活細胞的方法，下面介紹一些流式分析時區分死細胞和活細胞的簡單方法。

（1）對角線死細胞

通常都悉知對角線可以區分死細胞，那么為什么死細胞會聚集在對角線上呢？原因是死細胞也可以產生非特異性熒光，而且死細胞產生的非特異性的熒光要明顯強于活細胞，甚至強于熒光素產生的熒光信號。非特異性熒光的波長是沒有選擇性的，不局限于某一波長范圍，所以一般所有常用的熒光信號通道都能夠接收到死細胞產生的非特異性熒光信號，而且該信號在所有波長范圍的熒光強度相差不多，各個熒光通道接收到的熒光強度都是處于同一個等級的。因此，在散點圖上死細胞是位于對角線上的，而且不同的死細胞，其非特異性熒光的強度不同，并且差異性強度很大，所以從整體來看，死細胞的非特異性熒光強度呈現從低到高的連續性分布，表現在散點圖上死細胞剛好處于對角線上，如圖1-A所示呈線性，與活細胞群體的圓形分布有明顯的區別，因此我們可以根據死細胞這一特性區分活細胞和死細胞。

圖1：對角線死細胞流式圖（來源于《流式細胞術》）

雖然死細胞位于散點圖的對角線上，但是對角線上的細胞確不一定是死細胞，因為雙陽性細胞如果在x軸和y軸的熒光信號相似時，也可以位于對角線上。所以，散點圖對角線上的細胞可能是死細胞，也可能是雙陽性細胞。如圖1-B所示，樣本細胞為正常小鼠脾臟細胞，標記 FITC-抗CD3抗體和PE-抗CD4抗體，FITC和PE雙陽性的CD4 T細胞和死細胞混在一起，無法區分。但是死細胞和雙陽性細胞的形狀是不一樣的，死細胞呈現連續的線型分布，而雙陽性細胞群呈現圓形的群體分布，因此，可以從對角線上的細胞群體的形狀大致判斷細胞的性質。雖然不能根據熒光強度的強弱來區分該熒光信號是來自于死細胞的非特異性熒光還是來自熒光素產生的熒光，但是可以利用在散點圖上死細胞位于對角線的特點來區分死細胞和陽性活細胞。如圖1-C所示，x軸表示FITC通道（樣本細胞標記有FITC-抗CD3抗體），y軸表示APC通道（閑置通道），借用該散點圖可以明確區分圖1-B中無法區分的死細胞和雙陽性細胞。此時只需要將排除了死細胞后的CD3 T細胞設門，將門內的細胞顯示于新的FITC-PE散點圖中，如圖1-D，此時該散點圖內的細胞都是活細胞，因為樣本細胞同時標記有PE-抗CD4抗體，所以圖中的細胞明顯分為兩群，雙陽性的是CD4T細胞，單陽性的是CD8 T細胞。

（2）PE-Cy5通道非標記陽性細胞

PE-Cy5通道（通常是FL3，接收的熒光波長范圍大致為655-685nm）有時可用于識別死細胞，但首先該通道必須是閑置的通道，及樣本細胞中沒有標記該通道代表的熒光素（PE-Cy5、PerCP等）偶聯抗體。選擇PE-Cy5-SSC散點圖，一般可看到不成群的PE-Cy5陽性細胞，這些陽性細胞的SSC值也是散在分布的，這些散在的PE-Cy5通道非標記陽性細胞，即圖2-A中的紅色部分，將這部分細胞設門顯示于FITC-PE散點圖中，如圖2-B所示，這部分PE-Cy5通道非標記陽性細胞基本都位于對角線部分，而對角線細胞一般為死細胞，所以散在的PE-Cy5通道非標記陽性細胞一般就是死細胞。

圖2 PE-Cy5通道非標記的陽性細胞（來源于《流式細胞術》）

因此利用PE-Cy5通道非標記陽性細胞區分活細胞和死細胞時，可以先在FSC-SSC圖中選擇目標所在的細胞群，將其設門，然后將門內的細胞顯示于PE-Cy5-SSC散點圖中，排除PE-Cy5通道非標記陽性細胞代表的死細胞，將PE-Cy5陰性細胞設門，然后將門內的細胞顯示于新的流式圖內分析，這是該流式圖內的細胞都是活細胞，分析或者分選時就可以盡量排除死細胞的干擾了。

以上兩種排除死細胞的方法只是一種經驗的方法，一般在實驗要求不高或者預實驗時使用，流式分析時可以借鑒這兩種方法區分死細胞和活細胞，但是不能將這兩種方法作為區分死細胞和活細胞的標準方法，使用死活細胞染料，例如常見的7-AAD，PI和Zombie Dyes系列等才是標記死活細胞的正確方法。

(3) 7-AAD、PI標記死細胞

7-AAD（7氨基放線菌素D）與PI（碘化丙啶）是經典的核酸標記染料，在流式細胞術中能夠用于標記死細胞，以排除死細胞對實驗結果的干擾。7-AAD的熒光信號被PerCP通道接收，所以7-AAD不能與PerCP或PE-Cy5偶聯的抗體共同標記樣本細胞。但其發射的熒光波長基本不與PE發射的熒光重疊，因此可以與和PE共同標記樣本細胞。而PI染料被激發后發射的熒光波譜范圍很大，常規FL2、FL3都能接收到其熒光信號，并且與PE、PerCP、PE/Cy5熒光素發射的熒光波長有很大程度的重疊，因此PI染料不宜與這些染料共標記。

7-AAD、PerCP、PE、PI、PE/Cy5發射光譜： 

（4）Zombie Dyes標記死細胞

當流式檢測只分析細胞表面抗原分子，且不對樣本固定時，7-AAD和PI是比較理想和經典的方法。但是如果需要分析細胞內的分子，如檢測胞內細胞因子、胞內活化的激酶和核內分子等需要固定樣本細胞，在胞膜上打孔，使熒光素偶聯抗體能夠通過細胞膜進入細胞內，與相應目標分子結合，這時7-AAD與PI就無法鑒別死細胞和活細胞了。

圖為：體外培養一天的C57BL/6小鼠脾細胞做Annexin V/PI染色的流式數據。其中，左邊為未經固定處理的細胞上機檢測結果；右邊為經過70%EtOH, 1.5%PFA固定處理的細胞上機檢測結果。

圖為：體外培養一天的C57BL/6小鼠脾細胞做Annexin V/7-AAD染色的流式數據。其中，左邊為未經固定處理的細胞上機檢測結果； 右邊為經過70%EtOH, 1.5%PFA固定處理的細胞上機檢測結果。

Zombie Dyes有別于PI和7-AAD等DNA染料，它是一種可用于需固定細胞實驗的染料，通過與細胞上蛋白質的氨基結合來實現。因活細胞可排除染料，所以僅細胞膜被著色；而死細胞的細胞膜及細胞質均被著色，繼而根據熒光信號的強弱來區分死/活細胞。而且Zombie Dyes可選擇性多，可以由不同的激發光激發，便于靈活選擇。

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Zombie Dyes的發射光譜：

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