AAT熒光染料相關問題

1、AAT熒光染料與傳統染料相比有何優勢？

iFluor系列染料與傳統染料如 Cy3 Cy5 Cy7（from GE）相比水溶性好穩定性高PH不敏感、亮度高、價格低、背景值低，可以完美替代。

2、抗體標記的原理是什么？

對于iFluor系列的 SE（琥珀酰亞胺酯）染料，SE與抗體的氨基反應生產穩定的酰胺鍵；而對于APC、PE、HRP等大蛋白分子，預活化好的FOL的大蛋白，與需要連接在抗體上的MTA特異性結合。

3、標記好的抗體4度條件下可以儲存多久？

標記好的抗體當濃度大于等于1mg/ml，4度可儲存一年，當抗體濃度在0.1-0.5mg/ml時，可以加入0.2%BSA保存。

4、染料的保質期是多久？

在產品備注的儲存溫度條件下，以開封日起可存放一年。PS:DMSO 溶液不是很穩定，需要無水 DMSO，避免凍融循環。

5、標記的抗體或者蛋白大小有要求嗎？

建議不要小于20KD

6、有哪些抗體不適合用于標記？

不適合包含牛白蛋白血清（BSA），明膠，游離氨基酸(L-組氨酸)或銨鹽的抗體或蛋白質。

7、去除疊氮化鈉、硫酸銨或醋酸銨等這些雜質成分用什么？

只需要Cat#60502 spin filter一個柱子可去掉所有的這些雜質。

8、在標記大蛋白使用的MTA，必須搭配使用MTA清除劑使用嗎？

可以不用，因為這個group細胞里是沒有的。

9、 一抗抗體上可以結合幾個熒光素？不同抗體會不會鏈接上的熒光數量不同？

相同條件不會連的熒光數量不同，一般在2-4之間，不同的熒光染料略有不同。DOS＞４以后亮度增加不多，會更亮一些，但背景值可能會增加。對于不易淬滅的熒光可以標記到6。

10、標記的效率如何檢測？

iFluor 的標記我們是測純化后的dye/protein ratio，也有客戶用 Run SDS Gel的方法。

Buccutite的效率我們是用SEC的column來測的。

11、iFluor系列染料標記蛋白會不會影響被標記蛋白和別的蛋白的相互作用？

不會

12、AAT市售的抗體不同應用的抗體推薦稀釋比是多少？

Western Blot (WB): 1μg/ml，Immunofluorescence (IF): 2-10 μg/mL ，Flow Cytometry (Flow):  2-10 μg/mL

13、用AAT熒光標記的抗體更亮的原因是什么？

結構不同，在于熒光做了修飾，容易鏈接到抗體上而不易發生淬滅，比如一個抗體IF594能標4-6個，而AF594只有2-3個。

14、染料和蛋白的比例大概是多少？

大約摩爾比為1：15，在抗體濃度是1mg/ml時。

15、最常見的succinimidyl ester（琥珀酰亞胺酯）和Maleimide活性集團結合在抗體的什么部位？

SE跟抗體的-NH2連接形成類似于肽鍵的結構，從而連接到抗體上，這是最簡便的連接方式；Maleimide活性基團與巰基（-SH）結合，優點是只標記抗體Fc片段不會影響抗原抗體的結合部位。

16、抗體標記DPR值(抗體和熒光蛋白的比例)的參考范圍有沒有推薦？

這個與抗體和dye的比例有關，也與抗體的濃度有關，請參考不同染料的說明書，里面有建議的比例。

17、標記過后用什么柱子純化？

貨號為60500的柱子純化。

18、AAT iFluor熒光染料是否有自己的專利？我使用iFluor在自己的產品上時是否需要支付版權費用？

我們可以提供專利證明文件。從達科為購買AAT熒光染料，無需支付版權費。

19、MTA和FOL組合與SMCC標記大蛋白方法的最大優勢是什么？

交聯劑的一端（通過NHS酯）與氨基酸賴氨酸和N-末端中發現的胺（-NH2）反應，另一端（通過馬來酰亞胺）與氨基酸中發現的硫醇基團（-SH）反應半胱氨酸。然而，SMCC修飾的蛋白質極不穩定并且通常是自身反應性的，因為蛋白質通常含有胺和硫醇基團，其引起顯著量的自交聯。

操作簡單的抗體標記試劑盒問題

20、我的抗體中含有甘油可以用抗體標記試劑盒嗎？

甘油最好20% 以下

21、iFluor系列抗體標記試劑盒中的淬滅劑為什么可以淬滅掉沒連接在抗體上的熒光，而標記在抗體上的熒光卻不會被淬滅？

因為淬滅劑和未結合上的熒光是分子內的淬滅，而連在抗體上的熒光，是分子間的淬滅，只有很高濃度才會被淬滅。

22、抗體標記試劑盒的淬滅劑的成分是什么，可以單獨購買嗎？

淬滅劑是一種小分子，可以單獨購買，貨號為“標記試劑盒貨號+C”，例如1255C。

23、抗體標記試劑盒的淬滅劑可以淬滅APC、PE 這種大蛋白嗎？

不推薦，建議使用60500柱子純化。

24、我要做體內實驗擔心抗體標記試劑盒中的淬滅劑會影響實驗怎么辦。

1）不加淬滅劑，加10mM Glycine buffer 可以， 這樣dye 就沒有活性了。

2）可以用10K filter把小分子的dye 除去。

 https://www.aatbio.com/products/readiuse-10kd-spin-filter?unit=60502

25、iFluor系列染料和Buccutite試劑盒，標記蛋白或抗體的效率分別是多少呢？

iFluor 的標記是全標記上了，但是Buccutite的效率應該在80%以上。

26、Readlink試劑盒的reaction buffer成分是什么？

可以用1.0M NaHCO3 buffer or Phosphate buffer (pH=8.5)來調pH

27、iFluor系列抗體標記盒，我每次標記不了50ug，每次標記可不可以小于50ug？

可以小于50ug, dye用DMSO溶，等比例減少用量， 但是剩下的dye量很少，可能不太穩定。

28、如果我的抗體含有少量的BSA，是否可以使用抗體標記試劑盒？

可以，我們有BSA兼容的ReadiLink? xtra 系列抗體標記試劑盒，但是BSA的含量要在0.5%以內的標記效果是最好的。

 番 外：

1. 關于60502 這個產品的用法很靈活，主要有以下三方面的用途：

1）Concentrate volume （濃縮）

2）Desalting （除鹽，或除去小分子）

3）Deproteinization of biological samples （除蛋白）

從第二個用途來說和60500柱的用途是一樣的。但是推薦用60500，會除小分子更快更干凈一些。

2. 標記大蛋白SMCC方法簡要步驟： APC/SMCC和抗體/DTT分別過柱子,混合,封閉,濃縮,檢測。APC在標記前需要過柱子成PBS緩沖液；SMCC現用現配。

3. IgG的大小是150Kd

4.不同染料對比數據

5. 不同染料基本信息

6. 工業客戶推薦簡要的“原汁原味”Protocol實例

1) iFluor594, NHS, 1mg/vial, add 100uL anhydrous DMSO to prepare 10mg/ml solution.

2) Prepare Antibody 5mg/ml in PBS, 100uL

3) Add  5ul 1.0M NaHCO3 (pH=8.5-9.0) to adjust pH to 8.5-9.0

4) Add 3.9uL 10mg/ml  iFluor594, SE stock solution (10X labeling ratio)

5) Mix well, incubate at room temperature for 60min

6) Set up Spin column (Cat#60500), equilibrate column with PBS buffer

7) Collect elution

8) Measure Absorbance A280nm  and A594nm

https://www.aatbio.com/tools/degree-of-labeling-calculator

Target DOS >4

9) If DOS is lower than 4, need to add iFluor594, SE and relabel the conjugate until it reaches the target DOS.

7. 10mg/ml 每次標記20mg抗體實例

1) 10mg/ml in PBS, 2mL, Add 100uL reaction buffer to adjust pH

2) Dissolve iFluor488, SE in DMSO to make 10mg/ml

3) Add 8 eq. mole iFluor488, SE to IgG solution

4) Reaction for 60min

5) Pack 2 PD-10 columns (10mL gel/column)

6) Load 1mL reaction mixture,

7) Spin to purify the mixture

8) Collect the purified IgG-iF488 conjugate.

PD-10珠子的材料是聚丙烯酰胺，建議純化1500以下的小分子與分子量大于15，000以上的蛋白。